Vial de cultivo liquido

INSTRUCCIONES DE UTILIZACION DE LOS VIALES DE CULTIVO LÍQUIDO

1) Incluido:

-  Vial de Cultivo Líquido Mycomate®

-  Hisopos con alcohol estériles

-  Jeringa esterilizada y aguja calibre 18- Vial de Cultivo Líquido

2) Vas a necesitar:

- Llama de gas (un encendedor "tipo soplete" funciona bien)

- Las esporas que quieras inyectar en el vial de cultivo liquido.

- Manos limpias y un área aseada para trabajar

3) Inoculación:

Inyección y colonización del cultivo líquido:

1) Si el medio líquido de cultivo se encuentra refrigerado, retírelo del refrigerador y almacénelo a temperatura ambiente 24 horas antes de usarlo.

2) Lávese muy bien las manos (el uso de jabón antibacteriano es opcional). Séquese con una toalla limpia (p. ej. con toallas de papel).

3) Retire el vial de la bolsa y ubique en una mesa limpia en un área aseada, libre de residuos.

4) Aplique alcohol sobre el puerto de inyección del Vial de Cultivo Líquido y cualquier otro lugar destinado a ser inyectado (p. ej. vial de esporas o Vial de Cultivo Líquido). Utilice un hisopo limpio por cada producto que deba humedecer, con el fin de reducir la contaminación mutua. No exhale directamente sobre los sitios de inyección.

5) Retire la jeringa y la aguja de la bolsa. Retire la cubierta de plástico que protege la aguja (gire en el sentido de las manecillas del reloj y hale).

No permita que la aguja entre en contacto con ningún objeto, pues de lo contrario deberá volver a ser esterilizada. En caso de utilizar una jeringa de cualquier otro proveedor, ésta deberá también ser esterilizada.

Las agujas pueden ser esterilizadas con una llama. Es deseable que la aguja quede al rojo vivo, teniendo cuidado de no sobrecalentar y derretir el área donde la aguja está adherida al plástico. Siempre deje enfriar la aguja antes de inyectarla. (Ver foto a).

6) Si se utiliza un vial de esporas o de Cultivo Líquido colonizado, agite vigorosamente para mezclar la suspensión. Sostenga el vial en un ángulo, inyecte con la jeringa, y extraiga la cantidad deseada de suspensión. (Ver foto b).

7) Inyecte varias gotas de suspensión de cultivo (es decir, líquido colonizado del vial de cultivo) o entre varias gotas y 1 ml de suspensión de esporas (dependiendo de la densidad de la solución de esporas) en el Vial de Cultivo Líquido. Retire la aguja muy lentamente, pues de lo contrario la presión puede ocasionar que un poco del líquido sea rociado afuera—lo cual no representa problema alguno. (Ver foto c).

8) Limpie el puerto de inyección del Vial de Cultivo Líquido con un hisopo limpio humedecido en alcohol; deje secar, y almacene verticalmente en una bolsa plástica de cierre hermético.

9) Agite vigorosamente el vial una vez al día durante diez segundos y almacene lejos de la luz solar. Incube las especies de hongos a la temperatura apropiada (generalmente de 23º a 27º C). Una temperatura menor retrasa el tiempo de germinación y colonización de las esporas. Sin embargo, una temperatura demasiado alta (por encima de 27º C) incrementa el riesgo de contaminación.(Ver foto d).

Nota: Los requerimientos de temperatura dependen de la especie.

10) El crecimiento es similar tanto con esporas como con Cultivo Líquido. Sin embargo, el crecimiento con esporas tarda más que con éste último.

Suspensión de esporas: Las esporas generalmente tardan entre 24 y 72 horas en germinar, y entre 3 y 7 días deberá ser observable la colonización del medio líquido creciendo en los dos tercios inferiores del vial.

Nota: Los Viales de Cultivo Líquido MycoMate® requieren de muy pocas esporas para su crecimiento.

Cultivo líquido: El crecimiento se hace evidente durante las 24 horas siguientes a la transferencia del micelio desde un vial colonizado de Cultivo Líquido a viales de Cultivo Líquido frescos. Los viales frescos generalmente son colonizados tras varios días (dependiendo de la especie, variedad, y temperatura).

La observación es más efectiva cuando se sostiene con cuidado el vial a trasluz, evitando agitar. El sedimento del medio de cultivo puede agitarse si no se es lo suficientemente cuidadoso, haciendo más difícil identificar el crecimiento (esto no representa problema, pues al rato el sedimento se asentará nuevamente en el fondo). Hilos blancos de micelio (hongo) flotarán hacia la superficie a medida que levanta el vial. Deberá haber una pequeña nubosidad alrededor del micelio, pero el vial completo no debe estar opaco. El área alrededor de la nubosidad del micelio deberá ser razonablemente transparente. Si el vial es levantado lentamente y sin embargo aparece completamente opaco es posible que se encuentre contaminado. Deje reposar el vial sin ninguna perturbación durante varias horas y revise nuevamente para descartar que se trate de sedimento proveniente del fondo lo que oscurecía el vial. Éste puede ser utilizado tan pronto como haya crecimiento saludable o después de una o dos semanas cuando el vial muestre mayor colonización.

Nota: Cuando entre uno y dos tercios del vial han sido colonizados deberá ser utilizado o almacenado bajo refrigeración para uso posterior (ver abajo).

11)  Cuando la colonización esté completa el vial puede ser usado para inocular otros Viales MycoMate® de Cultivo Líquido (repitiendo los pasos del 1 al 10), Kits MycoMate®  para Hongos Comestibles o Esclerocios (repitiendo los pasos del 1 al 6)

4) almacenamiento:

Los Viales de Cultivo Líquido MycoMate® pueden ser utilizados para almacenamiento de cultivos tanto de corta como de larga duración, Incluyendo variedades multiespora, aisladas o clonadas. Un Vial de Cultivo Líquido puede ser utilizado para producir miles más. Una vez que el vial ha sido inoculado, y el micelio coloniza entre el 30% y el 65% del medio líquido, éste puede ser almacenado bajo refrigeración (entre 2º y 8º C) durante varios meses (o más) sin percibir por ello efectos nocivos. Almacene verticalmente en dos o tres bolsas plásticas selladas herméticamente. No se requiere agitar los cultivos durante este período.

Ahorre tiempo valioso: Cuando el cultivo líquido sea requerido, simplemente retire el vial del refrigerador y utilice.