Fiala di coltura liquida

ISTRUZIONI PER L'USO DELLE FIALE PER COLTURA LIQUIDA

1) In dotazione:

- Fiala di coltura liquida Mycomate®

- Tamponi alcolici sterili

- Siringa sterile e ago calibro 18 - Fiala per coltura liquida

2) Sono necessari

- Fiamma a gas (va bene un accendino tipo torcia ).

- Le spore che si desidera iniettare nella fiala di coltura liquida.

- Mani pulite e un'area pulita in cui lavorare.

3) Inoculazione:

Iniezione e colonizzazione della coltura liquida:

1) Se il terreno di coltura liquido è refrigerato, toglierlo dal frigorifero e conservarlo a temperatura ambiente 24 ore prima dell'uso.

2) Lavare accuratamente le mani (l'uso di sapone antibatterico è facoltativo). Asciugare con un asciugamano pulito (ad es. carta assorbente).

3) Rimuovere la fiala dalla busta e posizionarla su un tavolo pulito in un'area pulita e priva di detriti.

4) Applicare l'alcol sulla porta di iniezione della fiala per coltura liquida e su qualsiasi altro sito destinato all'iniezione (ad es. fiala di spore o fiala per coltura liquida). Utilizzare un tampone pulito per ogni prodotto da bagnare, al fine di ridurre la contaminazione reciproca. Non espirare direttamente sui siti di iniezione.

5) Estrarre la siringa e l'ago dalla busta. Rimuovere il coperchio di plastica che protegge l'ago (girare in senso orario e tirare).

L'ago non deve entrare in contatto con alcun oggetto, altrimenti deve essere risterilizzato. Se si utilizza una siringa di un altro fornitore, anche questa deve essere sterilizzata.

Gli aghi possono essere sterilizzati con una fiamma. È auspicabile che l'ago sia caldo, facendo attenzione a non surriscaldare e a non fondere l'area in cui l'ago è attaccato alla plastica. Lasciare sempre raffreddare l'ago prima di iniettare (vedi foto a).

6) Se si utilizza una fiala per coltura liquida di spore o colonie, agitare vigorosamente per miscelare la sospensione. Tenere la fiala inclinata, iniettare con la siringa e prelevare la quantità di sospensione desiderata (vedi foto b).

7) Iniettare nella fiala per coltura liquida alcune gocce di sospensione colturale (cioè il liquido colonizzato della fiala) o tra alcune gocce e 1 ml di sospensione di spore (a seconda della densità della soluzione di spore). Estrarre l'ago molto lentamente, altrimenti la pressione potrebbe far schizzare fuori parte del liquido, il che non è un problema (vedi foto c).

8) Pulire la porta di iniezione della fiala per coltura liquida con un tampone pulito inumidito con alcol; lasciare asciugare e conservare in posizione verticale in un sacchetto di plastica ermetico.

9) Agitare energicamente la fiala una volta al giorno per dieci secondi e conservarla al riparo dalla luce solare. Incubare le specie di funghi alla temperatura appropriata (generalmente 23-27°C). Una temperatura più bassa ritarda la germinazione e la colonizzazione delle spore. Tuttavia, una temperatura troppo elevata (superiore a 27°C) aumenta il rischio di contaminazione (vedi foto d).

Nota: i requisiti di temperatura dipendono dalla specie.

10) La crescita è simile sia con le spore che con la coltura liquida. Tuttavia, la crescita con le spore richiede più tempo rispetto alla coltura liquida.

Sospensione di spore: le spore impiegano generalmente 24-72 ore per germinare ed entro 3-7 giorni si dovrebbe osservare la colonizzazione del terreno liquido nei due terzi inferiori della fiala.

Nota: le fiale di coltura liquida MycoMate® richiedono pochissime spore per crescere.

Coltura liquida: la crescita è evidente entro 24 ore dal trasferimento del micelio da una fiala di coltura liquida colonizzata a fiale di coltura liquida fresche. Le fiale fresche sono generalmente colonizzate dopo alcuni giorni (a seconda della specie, del ceppo e della temperatura).

L'osservazione è più efficace se la fiala viene tenuta accuratamente in controluce, evitando di scuoterla. Il sedimento nel terreno di coltura può agitarsi se non si fa abbastanza attenzione, rendendo più difficile l'identificazione della crescita (non è un problema, perché il sedimento si depositerà di nuovo sul fondo dopo un po'). Quando si solleva la fiala, i fili bianchi del micelio (fungo) galleggiano in superficie. Dovrebbe esserci una piccola nuvolosità intorno al micelio, ma l'intera fiala non dovrebbe essere opaca. L'area intorno all'intorbidamento del micelio dovrebbe essere ragionevolmente chiara. Se la fiala viene sollevata lentamente ma appare completamente opaca, è possibile che sia contaminata. Lasciare riposare la fiala indisturbata per alcune ore e ricontrollare per escludere che siano stati i sedimenti del fondo a oscurare la fiala. Si può utilizzare non appena si verifica una crescita sana o dopo una o due settimane quando la fiala mostra un aumento della colonizzazione.

Nota: quando uno o due terzi della fiala sono stati colonizzati, è opportuno utilizzarla o conservarla in frigorifero per un uso successivo (vedi sotto).

11 ) Una volta completata la colonizzazione, la fiala può essere utilizzata per inoculare altre fiale di coltura liquida MycoMate® (ripetendo i passaggi da 1 a 10), kit di funghi commestibili MycoMate® o sclerozi (ripetendo i passaggi da 1 a 6).

4) conservazione:

Le fiale di coltura liquida MycoMate® possono essere utilizzate per la conservazione di colture a breve e lungo termine, comprese quelle multi-spore, isolati o varietà clonate. Una fiala di coltura liquida può essere utilizzata per produrne altre migliaia. Una volta che la fiala è stata inoculata e il micelio ha colonizzato tra il 30% e il 65% del terreno di coltura liquido, può essere conservata in frigorifero (tra 2°C e 8°C) per diversi mesi (o più) senza effetti dannosi. Conservare in verticale in due o tre sacchetti di plastica chiusi ermeticamente. Durante questo periodo non è necessario agitare le colture.

Risparmiate tempo prezioso: quando la coltura liquida è necessaria, basta togliere la fiala dal frigorifero e utilizzarla.